IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β-galactosidase सब्सट्रेटको एनालग हो, जुन अत्यधिक inducible छ। IPTG को inducer अन्तर्गत, inducer ले repressor प्रोटीनसँग एक जटिल बनाउन सक्छ, जसले गर्दा repressor प्रोटीनको रूप परिवर्तन हुन्छ, ताकि यसलाई लक्षित जीनसँग जोड्न सकिँदैन, र लक्षित जीन कुशलतापूर्वक व्यक्त गरिन्छ। त्यसोभए प्रयोगको क्रममा IPTG को सांद्रता कसरी निर्धारण गर्नुपर्छ? के जति ठूलो हुन्छ त्यति राम्रो हुन्छ?
पहिले, IPTG प्रेरणको सिद्धान्त बुझौं: E. coli को ल्याक्टोज ओपेरोन (तत्व) मा तीन संरचनात्मक जीनहरू, Z, Y, र A हुन्छन्, जसले क्रमशः β-galactosidase, permease, र acetyltransferase लाई एन्कोड गर्दछ। lacZ ले ल्याक्टोजलाई ग्लुकोज र ग्यालेक्टोज, वा allo-lactose मा हाइड्रोलाइज गर्दछ; lacY ले वातावरणमा रहेको ल्याक्टोजलाई कोशिका झिल्लीबाट पार गर्न र कोशिकामा प्रवेश गर्न अनुमति दिन्छ; lacA ले एसिटाइल समूहलाई एसिटाइल-CoA बाट β-galactoside मा स्थानान्तरण गर्दछ, जसमा विषाक्त प्रभाव हटाउनु समावेश छ। थप रूपमा, त्यहाँ एक अपरेटिङ अनुक्रम O, एक सुरुवात अनुक्रम P र एक नियामक जीन I छ। I जीन कोड एक दमनकारी प्रोटीन हो जुन अपरेटर अनुक्रमको स्थिति O मा बाँध्न सक्छ, जसले गर्दा ओपेरोन (मेटा) दबाइन्छ र बन्द हुन्छ। प्रारम्भिक अनुक्रम P को माथिल्लो भागमा क्याटाबोलिक जीन एक्टिभेटर प्रोटीन-CAP बाइन्डिङ साइटको लागि बाइन्डिङ साइट पनि छ। P अनुक्रम, O अनुक्रम र CAP बाइन्डिङ साइटले मिलेर lac ओपेरोनको नियामक क्षेत्र गठन गर्दछ। जीन उत्पादनहरूको समन्वित अभिव्यक्ति प्राप्त गर्न तीन इन्जाइमहरूको कोडिङ जीनहरू एउटै नियामक क्षेत्रद्वारा नियमन गरिन्छ।
ल्याक्टोजको अनुपस्थितिमा, लाख ओपेरोन (मेटा) दमनको अवस्थामा हुन्छ। यस समयमा, PI प्रमोटर अनुक्रमको नियन्त्रणमा I अनुक्रमद्वारा व्यक्त गरिएको लाख दमनकर्ता O अनुक्रममा बाँधिन्छ, जसले RNA पोलिमरेजलाई P अनुक्रममा बाँध्नबाट रोक्छ र ट्रान्सक्रिप्शन प्रारम्भलाई रोक्छ; जब ल्याक्टोज उपस्थित हुन्छ, लाख ओपेरोन (मेटा) प्रेरित गर्न सकिन्छ। यस ओपेरोन (मेटा) प्रणालीमा, वास्तविक प्रेरक आफैं ल्याक्टोज होइन। ल्याक्टोज कोषमा प्रवेश गर्छ र β-galactosidase द्वारा उत्प्रेरित हुन्छ र एलोल्याक्टोजमा रूपान्तरण हुन्छ। पछिल्लो, एक प्रेरक अणु को रूपमा, दमनकर्ता प्रोटीनमा बाँधिन्छ र प्रोटीन कन्फर्मेसन परिवर्तन गर्दछ, जसले ओ अनुक्रम र ट्रान्सक्रिप्शनबाट दमनकर्ता प्रोटीनको विघटन निम्त्याउँछ। आइसोप्रोपाइलथियोग्यालेक्टोसाइड (IPTG) को एलोल्याक्टोज जस्तै प्रभाव हुन्छ। यो एक धेरै शक्तिशाली प्रेरक हो, जुन ब्याक्टेरिया द्वारा मेटाबोलाइज गरिएको छैन र धेरै स्थिर छ, त्यसैले यो प्रयोगशालाहरूमा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ।
IPTG को इष्टतम सांद्रता कसरी निर्धारण गर्ने? उदाहरणको रूपमा E. coli लाई लिनुहोस्।
सकारात्मक पुनः संयोजक pGEX (CGRP/msCT) भएको E. coli BL21 आनुवंशिक रूपमा इन्जिनियर गरिएको स्ट्रेनलाई ५०μg·mL-१ Amp भएको LB तरल माध्यममा खोप लगाइएको थियो र ३७°C मा रातभर कल्चर गरिएको थियो। माथिको कल्चरलाई विस्तार कल्चरको लागि १:१०० को अनुपातमा ५०μg·mL-१ Amp भएको ५०mL ताजा LB तरल माध्यमका १० बोतलहरूमा खोप लगाइएको थियो, र जब OD600 मान ०.६~०.८ थियो, IPTG अन्तिम सांद्रतामा थपिएको थियो। यो ०.१, ०.२, ०.३, ०.४, ०.५, ०.६, ०.७, ०.८, ०.९, १.०mmol·L-१ हो। एउटै तापक्रम र एउटै समयमा इन्डक्सन गरेपछि, त्यसबाट १ एमएल ब्याक्टेरियाको घोल लिइयो, र ब्याक्टेरिया कोषहरूलाई सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा सङ्कलन गरियो र प्रोटिन अभिव्यक्तिमा विभिन्न IPTG सांद्रताको प्रभावको विश्लेषण गर्न SDS-PAGE को अधीनमा राखियो, र त्यसपछि सबैभन्दा ठूलो प्रोटिन अभिव्यक्ति भएको IPTG सांद्रता चयन गरियो।
प्रयोग पछि, यो पत्ता लाग्नेछ कि IPTG को सांद्रता सम्भव भएसम्म ठूलो छैन। यो किनभने IPTG मा ब्याक्टेरियाको लागि एक निश्चित विषाक्तता छ। सांद्रता भन्दा बढीले कोषलाई पनि मार्नेछ; र सामान्यतया भन्नुपर्दा, हामी आशा गर्छौं कि कोषमा जति घुलनशील प्रोटीन व्यक्त हुन्छ, त्यति नै राम्रो हुन्छ, तर धेरै अवस्थामा जब IPTG को सांद्रता धेरै उच्च हुन्छ, ठूलो मात्रामा समावेशीकरण गठन हुनेछ। शरीर, तर घुलनशील प्रोटीनको मात्रा घट्यो। त्यसकारण, सबैभन्दा उपयुक्त IPTG सांद्रता प्रायः जति ठूलो हुन्छ त्यति राम्रो हुँदैन, तर सांद्रता त्यति नै कम हुन्छ।
आनुवंशिक रूपमा ईन्जिनियर गरिएका स्ट्रेनहरूको प्रेरण र खेतीको उद्देश्य लक्षित प्रोटीनको उत्पादन बढाउनु र लागत घटाउनु हो। लक्षित जीनको अभिव्यक्ति केवल स्ट्रेनको आफ्नै कारकहरू र अभिव्यक्ति प्लाज्मिडबाट मात्र प्रभावित हुँदैन, तर अन्य बाह्य अवस्थाहरू जस्तै इन्ड्युसरको सांद्रता, इन्डक्सन तापक्रम र इन्डक्सन समयबाट पनि प्रभावित हुन्छ। त्यसकारण, सामान्यतया, अज्ञात प्रोटीन व्यक्त र शुद्धीकरण गर्नु अघि, उपयुक्त अवस्थाहरू चयन गर्न र उत्तम प्रयोगात्मक परिणामहरू प्राप्त गर्न इन्डक्सन समय, तापक्रम र IPTG सांद्रता अध्ययन गर्नु उत्तम हुन्छ।
पोस्ट समय: डिसेम्बर-३१-२०२१