IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β-galactosidase सब्सट्रेट को एक एनालग हो, जो अत्यधिक inducible छ।IPTG को इन्डक्शन अन्तर्गत, इन्ड्युसरले रिप्रेसर प्रोटीनको साथ एक जटिल बनाउन सक्छ, ताकि रिप्रेसर प्रोटीनको कन्फर्मेसन परिवर्तन हुन्छ, ताकि यसलाई लक्ष्य जीनसँग जोड्न सकिँदैन, र लक्ष्य जीनलाई कुशलतापूर्वक व्यक्त गरिन्छ।त्यसोभए प्रयोगको क्रममा IPTG को एकाग्रता कसरी निर्धारण गर्नुपर्छ?के ठूलो छ राम्रो?
पहिले, आईपीटीजी इन्डक्शनको सिद्धान्त बुझौं: ई. कोलाईको ल्याक्टोज ओपेरोन (तत्व) मा तीनवटा संरचनात्मक जीनहरू, Z,Y, र A हुन्छन्, जसले क्रमशः β-galactosidase, permease, र acetyltransferase लाई सङ्केत गर्छ।lacZ ले ल्याक्टोजलाई ग्लुकोज र ग्यालेक्टोजमा वा एलो-ल्याक्टोजमा हाइड्रोलाइज गर्छ;lacY ले वातावरणमा ल्याक्टोजलाई सेल झिल्लीबाट पार गर्न र कोशिकामा प्रवेश गर्न अनुमति दिन्छ;lacA ले एसिटाइल समूहलाई एसिटाइल-CoA बाट β-galactoside मा स्थानान्तरण गर्दछ, जसले विषाक्त प्रभाव हटाउन समावेश गर्दछ।थप रूपमा, त्यहाँ एक अपरेटिङ अनुक्रम O, एक सुरु अनुक्रम P र एक नियामक जीन I छ। I जीन कोड एक रिप्रेसर प्रोटीन हो जसले अपरेटर अनुक्रमको स्थिति O मा बाँध्न सक्छ, जसले गर्दा ओपेरोन (मेटा) दबाइन्छ र बन्द गरियो।प्रारम्भिक अनुक्रम P को अपस्ट्रीम catabolic जीन एक्टिभेटर प्रोटीन-CAP बाइन्डिङ साइटको लागि एक बाध्यकारी साइट पनि छ। P अनुक्रम, O अनुक्रम र CAP बाइन्डिङ साइट मिलेर लाख ओपेरोनको नियामक क्षेत्र गठन गर्दछ।तीन इन्जाइमहरूको कोडिङ जीनहरू जीन उत्पादनहरूको समन्वित अभिव्यक्ति प्राप्त गर्न एउटै नियामक क्षेत्रद्वारा विनियमित हुन्छन्।
ल्याक्टोजको अभावमा, लाख ओपेरोन (मेटा) दमनको अवस्थामा छ।यस समयमा, PI प्रमोटर अनुक्रमको नियन्त्रण अन्तर्गत I अनुक्रम द्वारा व्यक्त गरिएको लाख रिप्रेसरले O अनुक्रममा बाँध्छ, जसले RNA पोलिमरेजलाई P अनुक्रममा बाँध्नबाट रोक्छ र ट्रान्सक्रिप्शन इनिशिएसनलाई रोक्छ;जब ल्याक्टोज उपस्थित हुन्छ, लाख ओपेरोन (मेटा) लाई प्रेरित गर्न सकिन्छ यस ओपेरोन (मेटा) प्रणालीमा, वास्तविक इन्ड्युसर आफैं ल्याक्टोज होइन।ल्याक्टोज कोशिकामा प्रवेश गर्छ र β-galactosidase द्वारा उत्प्रेरित गरी allolactose मा रूपान्तरण गरिन्छ।पछिल्लो, इन्ड्युसर अणुको रूपमा, रिप्रेसर प्रोटीनसँग बाँध्छ र प्रोटीन कन्फर्मेसनलाई परिवर्तन गर्दछ, जसले O अनुक्रम र ट्रान्सक्रिप्सनबाट रिप्रेसर प्रोटीनको विच्छेदन गर्दछ।Isopropylthiogalactoside (IPTG) को allolactose जस्तै प्रभाव छ।यो एक धेरै शक्तिशाली इन्ड्युसर हो, जुन ब्याक्टेरिया द्वारा मेटाबोलाइज गरिएको छैन र धेरै स्थिर छ, त्यसैले यो प्रयोगशालाहरूमा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ।
IPTG को इष्टतम एकाग्रता कसरी निर्धारण गर्ने?उदाहरणको रूपमा ई. कोलाई लिनुहोस्।
सकारात्मक पुनः संयोजक pGEX (CGRP/msCT) भएको E. coli BL21 आनुवंशिक रूपमा इन्जिनियर गरिएको स्ट्रेनलाई 50μg·mL-1 Amp भएको LB तरल माध्यममा खोपिएको थियो, र रातभर ३७ डिग्री सेल्सियसमा कल्चर गरिएको थियो।माथिको संस्कृतिलाई विस्तार संस्कृतिको लागि 1:100 को अनुपातमा 50μg·mL-1 Amp समावेश भएको 50mL ताजा LB तरल माध्यमको 10 बोतलहरूमा खोप लगाइएको थियो, र जब OD600 मान 0.6~ 0.8 थियो, IPTG अन्तिम एकाग्रतामा थपियो।यो 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 हो।एउटै तापक्रम र एकै समयमा इन्डक्शन पछि, ब्याक्टेरियाको समाधानको 1 एमएल यसबाट लिइयो, र ब्याक्टेरियल कोशिकाहरूलाई सेन्ट्रीफ्यूगेसनद्वारा सङ्कलन गरियो र प्रोटीन अभिव्यक्तिमा विभिन्न IPTG सांद्रताको प्रभावको विश्लेषण गर्न SDS-PAGE को अधीनमा राखियो, र त्यसपछि। सबैभन्दा ठूलो प्रोटीन अभिव्यक्ति संग IPTG एकाग्रता चयन गर्नुहोस्।
प्रयोगहरू पछि, यो पत्ता लाग्नेछ कि IPTG को एकाग्रता सकेसम्म ठूलो छैन।यो किनभने IPTG को ब्याक्टेरिया को एक निश्चित विषाक्तता छ।एकाग्रता भन्दा बढिले पनि सेललाई मार्नेछ;र सामान्यतया भन्नुपर्दा, हामी आशा गर्छौं कि कोषमा जति धेरै घुलनशील प्रोटीन व्यक्त हुन्छ, त्यति राम्रो हुन्छ, तर धेरै अवस्थामा जब IPTG को एकाग्रता धेरै उच्च हुन्छ, ठूलो मात्रामा समावेशीकरण बन्नेछ।तर शरीरमा घुलनशील प्रोटिनको मात्रा घट्यो।तसर्थ, सबैभन्दा उपयुक्त IPTG एकाग्रता अक्सर ठूलो हुँदैन, तर कम एकाग्रता।
आनुवंशिक रूपमा ईन्जिनियर गरिएको स्ट्रेनहरूको इन्डक्शन र खेती गर्ने उद्देश्य लक्ष्य प्रोटीनको उत्पादन बढाउन र लागत घटाउनु हो।लक्षित जीनको अभिव्यक्ति तनावको आफ्नै कारक र अभिव्यक्ति प्लाज्मिडले मात्र प्रभावित हुँदैन, तर अन्य बाह्य अवस्थाहरू, जस्तै प्रेरणकको एकाग्रता, प्रेरण तापमान र प्रेरण समयले पनि प्रभावित हुन्छ।त्यसकारण, सामान्यतया, अज्ञात प्रोटिन अभिव्यक्त र शुद्ध हुनु अघि, उपयुक्त अवस्थाहरू चयन गर्न र उत्कृष्ट प्रयोगात्मक परिणामहरू प्राप्त गर्न इन्डक्शन समय, तापक्रम र IPTG एकाग्रता अध्ययन गर्नु उत्तम हुन्छ।
पोस्ट समय: डिसेम्बर-31-2021